W5——实验设计(第六章）
实验设计的五大要素：
实验动物
染毒途径
染毒剂量
观察指标
观察周期
一、实验动物的选择
Ø 物种：特定靶器官
Ø 品系：近交系、杂交群、封闭群
Ø 微生物级别：
Ø 性别：雌雄各半
Ø 年龄：刚断乳
Ø 体重：
Ø 其他：生理状态、健康状态
实验动物的物种和品系
选择原则：
毒性反应与人近似
易于饲养、操作方法
繁殖力较强，数量较大
价格较低，易于获得
Ø啮齿类（rodent species）
小鼠：昆明种、NIH、ICR
大鼠：Sprague-Dawley（SD）、Wistar
Ø 非啮齿类（nonrodent species）：兔，犬或猴
实验动物的年龄和体重
刚成年、健康、未曾交配和受孕的动物
小动物根据体重
同一次试验同一批实验动物体重变异范围不应超过平均体重的20%
大鼠：180-240g
小鼠：18-25g
家兔：2-2.5kg
微生物学寄生虫学等级和饲养环境
Ø 尽可能使用高等级实验动物，在符合国家实验动物标准的试验环境中进行
Ø 国家实验动物微生物学和寄生虫学等级及监测分类，分四级：普通级、清洁级、无特定病原体级(SPF级)、无菌级
Ø 应使用清洁级及以上等级大小鼠，并饲养在屏障环境内进行试验
实验动物的性别
雌雄各半
如雌、雄动物毒效应有明显差异，应分别并求出雌性和雄性动物的LD50值
特殊的试验研究可仅作单一性别的急性毒性试验（如生殖毒性）
实验动物的预检
给药前检疫观察
大、小鼠、兔、豚鼠1周，犬猴2~3周
适应新环境，减少环境和生理条件变化可能对试验结果的影响
筛检健康状况不符合试验要求的动物
实验动物的给药前禁食处理
经口途径染毒，实验动物胃肠道内食物存留量对化学毒物的毒性可产生较明显的干扰
大、小鼠隔夜禁食，染毒2h后提供饲料
经口多次染毒可不禁食
二、染毒方式
模拟实际接触的途径和方式
有利于不同化学物之间结果的比较
受试物的性质和用途
受试物毒性评价程序的要求
1、受试物及处理
受试物种类
水溶液、混悬液、油溶液
水溶性受试物，蒸馏水、去离子水、生理盐水，保持与体内渗透压一致
水不溶性受试物，溶于或悬浮于适当的有机溶剂中
受试物一般应临用前新配
适宜容积染毒
毒性较大的受试物给药量较小
毒性较低的受试物常需较大量的染毒
给药容积根据染毒途径和实验动物
经口：20ml/kg(空腹动物)
经皮：2ml/kg
静脉：1ml/kg(5min以上)
2、剂量选择
剂量选择原则
参考新化学物的理化性质
参考相关资料
先用少量动物，以较大的剂量间隔染毒，找出10%-90%（或0%-100%）的致死剂量范围，然后设计正式实验的剂量和分组
根据类似试验所选的LD50计算方法确定剂量组数
剂量选择（预实验）
有参考资料的LD50-预期毒性中值，上下1-2个剂量组
无资料可参考1mg/kg最低，4倍组距
对于毒性很小的，以最大耐受量为试验剂量 WHO规定：经口5mg/kg; 经皮2mg/kg; 经呼吸道5ml/L数
3、染毒方法
染毒途径
消化道、呼吸道、皮肤、注射
工业毒物：经呼吸道、皮肤
农用化学物：经口、皮肤、呼吸道
药品：经口、注射、皮肤
食品：经口
环境污染物：经口、呼吸道、皮肤
染毒途径影响受试物急性毒性
不同途径的吸收量和吸收速率
吸收速率：静脉注射>呼吸道>肌肉注射>腹腔注射>皮下注射>消化道>皮内注射>经皮
同一受试物不同染毒途径LD50的大小通常符合上述规律
经口（胃肠道）染毒
LD50值来比较不同化学物急性毒性大小
灌胃：溶液或混悬液，以注射器经导管注入胃内，等容量灌胃法
吞咽胶囊：将受试物装入胶囊中，放至舌后部，迫使动物咽下。犬、猴
喂饲：将受试物掺入动物饲料或饮水中供实验动物自行摄入
经呼吸道染毒
吸入染毒
静式吸入染毒
动式吸入染毒
气管内注入
静式吸入染毒
方法：一定体积的密闭容器，加入易挥发的液态或气态受试物
染毒柜体积、动物数、时间，依据实验动物最低需气量计算
优点：简单、方便、受试物消耗少，适合于小鼠
缺点：氧气减少，浓度不稳定，经皮吸收，不适合稍大动物，挥发性
动式吸入染毒
将实验动物处于有空气流动的染毒柜中，新鲜空气不断流入，污染空气不断流出。温度、湿度、氧及二氧化碳分压相对恒定，并有随时补充受试物，维持浓度稳定。可采样监测受试物浓度，可持续接触受试物，无时间限制
经皮肤染毒
农药、化妆品、工业、环境、外用药物
常用大鼠
染毒方式
脱毛：化学或机械法脱毛（体表面积的10%）
染毒：局部涂敷或大鼠、小鼠浸尾法
经注射途径染毒
注射药品、机制研究、毒物代谢动力学
三、实验设计原则
实验设计的统计学原则
重复：重现性和重复数，实验重复的数量和质量，实验条件的严密性和代表性(典型和普遍)
随机：均衡随机
对照：齐同可比，阳性对照
实验研究的三大要素：
处理因素
研究者根据研究目的而施加于受试对象的刺激
主要指外源性化学物
处理因素的数目和水平，单/多因素设计
处理因素的标准化，最适条件
受试对象（均衡性）
首先考虑代谢与毒性效应上与人一致
注重对受试物毒性敏感的动物物种
种属差异
品系差异
个体差异，性别、年龄、体重、生理状况
试验效应
指标的有效性
指标的客观性
指标的准确度和精密度
指标的灵敏度，特异度
指标选择的数目，标准化
体内毒理学实验设计原则
实验动物：结果变异性、显著水平、实验把握度、意外原因
染毒途径及方式
对照设置
剂量及分组
观察指标
实验期限
体外毒理学实验设计
微生物：筛选致突变性和致癌性
哺乳动物：器官水平、细胞水平、亚细胞及分子水平
代谢活化：肝S9，肝微粒体组分、哺乳动物细胞介导、宿主介导实验
体外实验系统：脏器灌流、脏器切片、细胞培养、胚胎干细胞、亚细胞组分
四、毒理学实验结果分析（自学）
好像实验课会讲？